Нейтрофилы

Нейтрофилы — это относительно небольшие клетки крови диаметром 9-12 мкм. Несмотря на малые размеры, они являются профессиональными охотниками за микробами и первой линией защиты организма.

Нейтрофилы бедны митохондриями. Это свидетельствует о том, что окислительное фосфорилирование не является основным источником получаемой клеткой энергии. Вместе с тем в цитоплазме зрелых интактных нейтрофилов присутствуют запасы гликогена, которые позволяют клетке совершать достаточно большой объем работы за счет анаэробного гликолиза. Потребляемый кислород используется преимущественно при реализации бактерицидных эффектов.

Для сравнения: моноцит получает не менее половины своей энергии путем окислительного фосфорилирования.

 

Развитие нейтрофилов

Жизненный цикл нейтрофила составляет приблизительно две недели. Причем, почти все это время он проводит в костном мозге. В его развитии выделяют две фазы:

1. митотическую,
2. постмитотическую.

 

Митотическая фаза

В митотическую фазу (ее продолжительность примерно 7,5 дня) клетка проходит несколько циклов деления. Сначала образуется миелобласт посредством дифференцировки стволовой клетки. Уже на следующей стадии (промиелоцит) формируются азурофильные гранулы, содержащие ферменты (миелопероксидазу, дефензины, эластазу). Эти гранулы еще называются «первичными», так как они образуются первыми. Позднее, на стадии миелоцита, появляются специфические гранулы, несущие лактоферрин и лизоцим. Они получили название вторичных. Разделение гранул на первичные и вторичные пришло из гистологии и с функциональных позиций довольно условно.

 

Постмитотическая фаза

В постмитотическую фазу (ее продолжительность около 6,5 дня) нейтрофил прекращает делиться.

 

Движение нейтрофила

Основная функция нейтрофила — защита организма от локальных бактериальных инфекций. Для ее реализации ему необходимо проникнуть из кровяного русла в ткань. Процесс тканевой мобилизации является комплексным, в нем участвуют как лейкоциты крови, так и клетки сосудистого эндотелия. Он включает несколько последовательных этапов:

• роллинг,
• адгезию,
• диапедез.

Важно подчеркнуть, что контакт между нейтрофилами пристеночного пула и эндотелиоцитами осуществляется постоянно (в том числе и при отсутствии инфекционного процесса).

 

Роллинг

Маргинально расположенные нейтрофилы в норме находятся в состоянии качения — роллинга — в направлении движения крови. Образно говоря, они катятся, «как мячи по тротуарной плитке». Физиологический роллинг обусловлен присутствием на нейтрофилах маргинального пула лектиновых (способных связываться с углеводными структурами) адгезивных молекул, относящихся к группе селектинов. Это одноцепочечные трансмембранные протеины, имеющие в своем составе ряд внешних доменов и один внутренний (цитоплазматический) домен.

Селектины лейкоцитов называют L-селектинами. Они взаимодействуют с сиаломуцином (CD34), расположенным на поверхности эндотелиальных клеток. Возникающие контакты не только поддерживают роллинг, но и являются достаточными для противодействия движению крови (скорость кровотока выше линейной скорости катящегося нейтрофила).

 

Адгезия и диапедез

При развитии местной воспалительной реакции под влиянием локально образующихся провоспалительных агентов (TNF-α, IL-β, С5а-компонента комплемента, бактериального липополисахарида (LPS)) в прилегающих к очагу сосудах происходит активация эндотелиоцитов и нейтрофилов. Эндотелиальные клетки начинают экспрессировать на своих мембранах сначала Р-селектин, а затем Е-селектин и секретировать хемокин IL-8. В свою очередь IL-8, воздействуя на нейтрофилы маргинального пула, вызывает исчезновение с их поверхности L-селектина и индуцирует появление на мембранах лейкоцитов β₂-интегрины — адгезивные молекулы. В отличие от селектинов, они представлены двумя полипептидными цепями:

1. общей для семейства β₂-цепью,
2. индивидуальной α-цепью.

К настоящему времени известно 4 представителя β₂-интегринов. Это:

• LFA-1 (leukocyte function-associated molecule — молекула, ассоциированная с функцией лейкоцитов (CD11a/CD18),
• клеточные рецепторы к iC3b-фрагменту комплемента:
  • CR3 (CD11b/CD18),
  • CR4 (CD11c/CD18),
• лейкоинтегрин aDβ₂ (CD11d/CD18)).

События, приводящие к вызванной воспалением мобилизации нейтрофилов, обычно разделяют на две фазы:

1. селектинзависимую,
2. интегринзависимую.

Первая селектинзависимая фаза (или фаза усиления роллинга) обусловлена экспрессией на эндотелиоцитах P- и E-селектинов. P-селектин имеет на поверхности нейтрофила свой лиганд — PSGL-1 (P-selectin glycoprotein specific ligand — специфический гликопротеиновый лиганд для P-селектина (CD162)). Кроме того, и P-селектин, и E-селектин активно взаимодействуют с мембранными углеводами нейтрофила, содержащими Lewis a и Lewis b. P-селектин связывается преимущественно с gp150-Lewis X (CD15), а E-селектин — с sialo-Lewis X.

Известно, что в приведенных выше рецепторных взаимодействиях важную роль играет не только лектиновый домен селектинов, но и их EGF-подобный домен.

Следует отметить, что усиление роллинга проявляется не повышением скорости движения нейтрофила (она, наоборот, замедляется), а увеличением численности полиморфноядерных лейкоцитов пристеночного пула. Принципиально важным является то, что в реализации первой фазы воспалительной мобилизации нейтрофилов основная роль принадлежит эндотелиальным клеткам.

Секреция эндотелиоцитами IL-8 вызывает развитие следующей интегринзависимой фазы воспалительной мобилизации нейтрофилов. Как уже отмечалось, этот хемокин не только приводит к исчезновению L-селектина с поверхности потенциальных фагоцитов, но и стимулирует экспрессию на их мембране b2-интегринов (готовые молекулы LFA-1 и CR3 присутствуют в специфических гранулах). Аналогичными эффектами в отношении нейтрофилов обладает фактор активации тромбоцитов (PAF — platelet activating factor), продуцируемый эндотелиоцитами и тучными клетками в очаге нейтрофильного воспаления.

Появление лейкоинтегринов сопровождается значительным усилением адгезивных контактов между нейтрофилами и эндотелиальными клетками. Так, LFA-1 обладает высоким сродством к молекулам межклеточной адгезии ICAM (intercellular adhesion molecules), относящимся к суперсемейству иммуноглобулинов. ICAM-2 (CD102) постоянно присутствует на поверхности эндотелиоцитов. Развитие нейтрофильного воспаления индуцирует экспрессию на мембране эндотелиальной клетки еще одной молекулы адгезии — ICAM-1 (CD54), которая способна взаимодействовать как с LFA-1, так и с CR3.

Таким образом, во вторую интегринзависимую фазу воспалительной мобилизации нейтрофилов происходит прекращение процесса роллинга (отсутствие L-селектина). Лейкоциты останавливаются и при посредстве β₂-интегринов прилипают к активированным провоспалительными медиаторами эндотелиальным клеткам. Процесс адгезии является обратимым. Он связан с активностью внутриклеточных киназ, контролирующих степень фосфорилирования цитоплазматических доменов β₂-интегринов. И хотя это явление затрагивает обе цепи интегриновой молекулы, стабильность адгезии в основном зависит от уровня фосфорилирования β-цепи.

Для проникновения сквозь сосудистую стенку лейкоцит использует соприкасающиеся между собой поверхности эндотелиоцитов. После вступления нейтрофила в плотный контакт с сосудистым эндотелием он с помощью LFA-1 распознает присутствующие на границе соседствующих эндотелиоцитов структуры JAM-1 (junction adhesion molecule — адгезивная молекула межклеточных соединений) и формирует в этом месте псевдоподию. Прилипание эндотелиальных клеток друг к другу обусловлено присутствием на их боковых поверхностях адгезивных молекул CD31. Эти молекулы, находясь на противоположных клеточных поверхностях, способны взаимодействовать между собой, образуя соединение по типу «замка-молнии». Внедрение лейкоцитарной псевдоподии между эндотелиоцитами также происходит после экспрессии на ее конце CD31-структур. Нейтрофил вскрывает эндотелиальную «застежку», используя те же самые молекулы CD31.

При своем продвижении он формирует новые (лейкоцитарно-эндотелиальные) CD31-CD31-соединения. Достигнув базальной мембраны, нейтрофил секретирует протеазы (эластазу, коллагеназу), расщепляя волокна соединительной ткани и расчищая себе путь для дальнейшего продвижения. Продавливание ядра и цитоплазмы в образовавшуюся щель завершает процесс диапедеза.

 

Хемотаксис нейтрофилов

Последующая миграция лейкоцита основана на хемотаксисе — направленном движении по градиенту концентрации веществ (хемоаттрактантов), к которым он имеет клеточные рецепторы.

Для инициации хемотаксиса необходимы два условия: содержание хемоаттрактанта в окружающей среде не менее 10 М и перепад его концентрации вдоль тела клетки не менее 1%. Зрелые нейтрофилы способны двигаться со скоростью 1000 мкм/ч, скорость незрелых — в несколько раз меньше. Поэтому сосудистая система является важнейшим транспортным средством доставки лейкоцитов к очагу воспаления. Нейтрофил за пределами кровяного русла выглядит совершенно иначе, чем в кровотоке (не «катящийся шар», а распластанная клетка). Его движения связаны с полимеризацией прилегающего к внутренней стороне мембраны актина. Рецепторы к хемоаттрактанту (хемотаксину) смещаются на задний (относительно направления миграции) полюс клетки, поглощаются внутрь и затем вновь реэкспрессируются на ее передней поверхности.

В очаге воспаления нейтрофил находится в окружении многих хемотаксинов. В качестве важнейших из них следует выделить N-формил-метионил-пептиды и С5а. N-формил-метионин является облигатным продуктом синтеза бактериальных белков. С него часто инициируется трансляция протеинов у прокариотов. Производные этого продукта (например, N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин) не только стимулируют хемотаксис нейтрофилов, но и вызывают секрецию содержимого специфических гранул и усиление мембранной экспрессии CR3 и цитохрома b. С5а является анафилотоксином, возникающим при расщеплении комплемента (эндогенный продукт) и в этом плане не имеет специфики, связанной с инфицирующим агентом. Обладая мощным хемотаксическим потенциалом в отношении нейтрофилов, С5а (как и его инактивированная форма C5adesArg) мобилизует их в воспалительный очаг независимо от присутствия или отсутствия в нем бактерий.

Еще один эндогенный хемоаттрактант — IL-8. Он относится к группе a-хемокинов (содержит Cys-X-Cys-мотив). IL-8 может оказывать влияние как на полиморфноядерные клетки, так и на T-лимфоциты, что определяется его концентрацией. При высоком содержании хемокин вызывает направленную миграцию нейтрофилов, при низком — Т-лимфоцитов. Способностью продуцировать IL-8 обладают многие клетки:

• эндотелиоциты,
• нейтрофилы,
• моноциты/макрофаги,
• лимфоциты,
• эозинофилы,
• фибробласты,
• гепатоциты,
• хондроциты,
• кератиноциты.

Провоспалительные цитокины, как правило, вызывают активацию нейтрофила и снижают порог его чувствительности к хемоаттрактантам. Действие LPS, наоборот, парализующее. Он может снижать хемотаксис, обусловленный IL-8, но, в то же время, не влияет на миграцию нейтрофилов, вызванную N-формил-метионил-пептидами.

Мембранные рецепторы к хемоаттрактантам представляют собой родственные структуры, относящиеся к родопсиновому суперсемейству. В него также входят светочувствительные рецепторы сетчатки глаза, рецепторы к нейропептидам, катехоламиновые и серотониновые рецепторы. Хемотаксиновый рецептор имеет семь трансмембранных доменов, три наружных и три цитоплазматических петли.

Его способность взаимодействовать с хемоаттрактантом регулируется цитозольным ГТФ/ГДФ-связывающим G-протеином. G-протеин чувствителен к действию холерного и коклюшного токсинов, что объясняет феномен подавления хемотаксиса этими субстанциями.

 

Распознавание чужеродных объектов

Попав в зону воспаления, нейтрофил оказывается в непосредственной близости от микроорганизмов, индуцировавших его мобилизацию. Однако для эффективной борьбы с инфектом ему необходимо распознать и поглотить чужеродный объект. Процесс распознавания основан на рецепторном взаимодействии фагоцита и бактериальной клетки. В то же время совершенно очевидно, что нейтрофил не может иметь в своем арсенале специфические рецепторы для огромного множества болезнетворных микроорганизмов. С этой целью используются универсальные гуморальные субстанции, называемые опсонинами.

 

Опсонины

Опсонины — собственные продукты макроорганизма, выступающие в роли посредников между рецепторами на поверхности мембран фагоцитирующих клеток и структурами бактерий, располагаемыми на поверхности. Фагоцитами они распознаются только после их адсорбции на микробной клетке.

Другими словами: нейтрофил распознает объект как чужеродный после того, как на нем произойдет связывание опсонина.

Наиболее важными опсонинами являются инактивированный компонент комплемента іСЗb и антитела класса G. Притом на начальной стадии инфекционного процесса, когда уровень антимикробных антител довольно низкий, главную роль в опсонизации играет iСЗb. Нейтрофил имеет три типа рецепторов к комплементу:

1. CR1,
2. CR3,
3. CR4.

CR3 и CR4 (β₂-интегрины) обладают способностью связывать фиксированный на бактериальной клетке iСЗb. CR1 — вспомогательный рецептор, необходимый в ситуациях, когда СЗb на микробной мембране не инактивирован. Взаимодействие CR1-СЗb приводит к инактивации СЗb под действием фактора I комплемента. В реализации процесса поглощения для нейтрофилов наиболее важен CR3; у моноцитов и макрофагов приоритетное значение имеет CR4.

Распознавание нейтрофилом объекта при посредничестве антител класса G происходит за счет Fcγ-рецептора (FcγR). Fcγ-рецептор связывается с Fc-фрагментом антитела, вступившего во взаимодействие с антигеном (но не свободной молекулой).

Известно три разновидности Fcγ-рецепторов:

1. FcγRI (CD64),
2. FcγRII (CD32),
3. FcγRIII (CD16).

FcγRI — высокоаффинный рецептор, присутствующий на макрофагах. Связывающая активность FcγRII и FcγRIII существенно ниже. Они обнаружены на нейтрофилах и макрофагах. Рецепторы для антител класса M на фагоцитах отсутствуют, однако имеются рецепторы для иммуноглобулинов класса А.

В роли опсонинов могут выступать и другие белки, например, LPS-связывающий протеин и септин. Оба они способны непосредственно взаимодействовать с наружной мембраной грамотрицательных бактерий, оба затем связываются с CD14 на поверхности фагоцита. Плотность CD14 высока на макрофагах; нейтрофилы начинают экспрессировать этот рецептор после активации такими медиаторами. как TNF-α, колониестимулирующие факторы и N-формил-метионил пептиды.

Еще один опсонин — С-реактивный белок (СРБ). Его концентрация в крови в период воспаления может увеличиваться в сотни и тысячи раз. Этот белок имеет сайты связывания для C-полисахарида пневмококка, фосфолипидов мембран, ДНК. Рецептор для СРБ на нейтрофилах отсутствует. Опсонизация происходит опосредованно — через активацию системы комплемента по классическому пути. Значение СРБ велико при воспалительных процессах неинфекционной этиологии. Будучи способным связываться с эндогенными структурами (поврежденными мембранами, ДНК, фибрином), он выступает в качестве основного опсонина стерильных очагов тканевой деструкции (инфаркт миокарда, закрытые травмы).

 

Нейтрофильное воспаление: поглощение и уничтожение микробов

Взаимодействие нейтрофила с опсонизированной частицей инициирует процесс ее поглощения внутрь клетки. Цепь событии можно разделить на несколько стадий:

1. рецепторный контакт с объектом поглощения,
2. формирование псевдоподии,
3. охватывание объекта по всей поверхности и смыкание псевдоподий,
4. образование фагосомы и смещение ее вглубь клетки.

Экспрессия опсониновых рецепторов на мембране нейтрофила усиливается во время хемотаксиса. Их связывание при контакте с объектом ведет к активации целого спектра мембраноассоциированных и цитоплазматических киназ и фосфолипаз, следствием чего является полимеризация актина, которая лежит в основе формирования псевдоподий. Весь процесс поглощения захватывает примерно две минуты. Образовавшаяся фагосома представляет собой опсонизированную бактерию или частицу, покрытую со всех сторон клеточной мембраной, которая продолжает нести на себе большую часть рецепторов и ферментов, но их ориентация при этом сменяется с наружной на внутреннюю и наоборот.

Важнейшей функцией нейтрофилов является уничтожение микробных клеток. Само по себе поглощение бактерий еще недостаточно для их ликвидации. Клетка, захватившая живой чужеродный объект, должна обладать достаточным литическим потенциалом чтобы самой не стать жертвой столкновения. В этом плане нейтрофил обладает самым мощным среди всех клеток организма разрушительным арсеналом. Для примера, его можно сравнить с «вооружением» макрофага.

Клеточные бактерицидные факторы обычно разделяют на кислородзависимые и кислороднезависимые. Последние представлены главным образом природными белковыми антибиотиками. Среди них известны α- и β-дефензины, кателицидины, серпроцидины (семейство нейтральных сериновых протеаз), профенины, протегрины и др. Природные микробицидные белки выявлены у животных, насекомых и растений. Обнаружены они и у людей.

 

Исход нейтрофильного воспаления

Процесс разрушения бактериальных агентов обычно завершается апоптозом нейтрофила. Индукторами апоптоза могут служить метаболиты кислорода, а также нейтральные сериновые протеазы. На мембранах апоптотирующих нейтрофилов появляются молекулы тромбоспондина и фосфатидилсерина — маркеры для распознавания и последующего поглощения макрофагами. Врожденный дефицит НАДФ-Н оксидазы (в отличие от дефицита миелопероксидазы) сопровождается снижением активности апоптотических процессов и нарушением экспрессии фосфатидилсерина на поверхности отмирающих нейтрофилов. Это препятствует их удалению макрофагами и ведет к развитию тяжелого заболевания — хронической гранулематозной болезни. Наличие в окружении нейтрофила провоспалительных цитокинов (TNF-α, IFN-γ, IL-1) и колониестимулирующих факторов (G-CSF, GM-CSF) также тормозит развитие программной гибели клетки.

Длительное присутствие провоспалительных цитокинов в очаге инфекционного воспаления, как правило, свидетельствует о недостаточной эффективности защитных реакций нейтрофилов. Причины этого могут быть различными: высокий уровень патогенности и большое количество инвазирующих микроорганизмов, обширная зона тканевой деструкции, недостаточный уровень опсонинов. Затяжной характер процесса при стерильном воспалении обычно связан с пролонгированным действием этиологического фактора, который может быть экзогенным (по природе — химическим или физическим) и эндогенным (отложение солей, присутствие аутоантител или иммунных комплексов).

Развитие бактериального гнойного процесса обычно является показателем дефицита опсонинов. При этом большое количество гноя отражает высокий мобилизационный резерв нейтрофилов. Однако их бактерицидная функция (важнейшим проявлением которой является внутриклеточное уничтожение микробов) оказывается недостаточной. Ярким примером развития такой ситуации является фурункулез. Введение больному антистафилококковых антител или проведение курса иммунизации стафилококковым анатоксином, как правило, дает позитивный результат. Назначение антибиотиков обычно также направлено на повышение бактерицидного потенциала организма. Необходимо подчеркнуть, что vivo антибактериальное действие фармацевтических препаратов является лишь дополнением к мощному защитному арсеналу организма и является малоэффективным при его разрушении (первичные иммунодефициты, острая лучевая болезнь, СПИД и тд.).

Затяжной характер нейтрофильного воспаления может поддерживаться самими нейтрофилами через продукцию PAF, IL-8, LTB₄. Из них наиболее эффективен для притока нейтрофилов LTB₄. Этот метаболит 5-липоксигеназного пути превращения арахидоновой кислоты (арахидоновая кислота высвобождается под действием фосфолипазы А₂ из фосфолипидов мембраны) не только вызывает увеличение проницаемости сосудов, но и усиливает экспрессию молекул адгезии на эндотелиальных клетках, стимулирует хемотаксис и дегрануляцию нейтрофилов. Затухание воспалительной реакции обычно сопровождается подавлением продукции LTB₄.

Данные, полученные Чарльзом Сераном, свидетельствуют о возможности прямого участия нейтрофилов в торможении воспалительного процесса. Известно, что нейтрофилы способны секретировать в окружающую среду лейкотриен A₄ (LTA₄ — метаболический предшественник LTB₄), который поглощается адгезированными тромбоцитами и превращается ими в липоксины.

Последние представляют собой мощные противовоспалительные факторы. Образование липоксинов может также протекать в самих нейтрофилах при участии 5-липоксигеназы — ключевого фермента синтеза лейкотриенов. В этой ситуации нейтрофилы захватывают 15S-гидроксиэйкозатриеновую кислоту (15S-HETE), образуемую близлежащими эпителиальными клетками и моноцитами под влиянием цитокинов IL-4 и IL-13. Важной особенностью этого пути образования липоксинов является параллельное угнетение продукции лейкотриенов, в том числе и LTB₄. Таким образом, нейтрофилы способны не только индуцировать развитие острого воспаления, но и активно участвовать в его подавлении.

Шмагель К.В.